Учёные создали новый метод визуализации, который позволяет фиксировать быстротечные процессы внутри живых клеток, недоступные для обычных микроскопов. Живые клетки непрерывно меняются, и долгое время получать чёткие снимки их мельчайших структур было сложной задачей. Традиционная сверхразрешающая микроскопия нередко требует сотен или тысяч кадров, чтобы показать объекты, слишком мелкие для стандартных световых микроскопов. Если структуры успевают сдвинуться за время съёмки, итоговое изображение получается размытым.
Новый подход получил название Spatial Polarization-Induced Fluorescence Fluctuation Imaging (SPIFFI) — пространственная поляризационно-индуцированная флуоресцентная флуктуационная визуализация. Его разработала группа под руководством Александры Раденович из Лаборатории наноразмерной биологии (LBEN) инженерной школы EPFL. Результаты опубликованы в журнале Nature Methods. Метод обеспечивает примерно двукратное улучшение разрешения и позволяет различать структуры размером от 160 до 170 нанометров, наблюдая за живыми клетками. Ключевое отличие в том, что все детали фиксируются за одну экспозицию камеры.
Многие существующие методики опираются на флуоресцентные молекулы, которые светятся под лазером. Учёные анализируют слабые изменения свечения на длинных сериях кадров и затем собирают из них более чёткую картину. Такой подход хорошо работает с химически зафиксированными клетками, где структуры не двигаются во время съёмки. В живых клетках митохондрии постоянно меняют форму, микротрубочки перестраиваются, а ДНК перемещается внутри клетки. Съёмка множества кадров занимает время, и структуры успевают сместиться до сборки финального изображения.
«По сути, прежние подходы использовали временную информацию для повышения пространственного разрешения, но на живых клетках это работает не очень хорошо», — поясняет первый автор работы, аспирант LBEN Вэй Го. Вместо накопления данных за множество экспозиций SPIFFI использует свойство флуоресцентного света, известное как поляризация. Флуоресцентные молекулы испускают свет, волны которого колеблются в определённых направлениях в зависимости от ориентации молекул. Эти различия несут пространственную информацию, которую обычная флуоресцентная визуализация использует не полностью. Система разделяет излучаемый свет на четыре канала, каждый из которых чувствителен к своей поляризационной составляющей, и сравнение четырёх снимков одной экспозиции позволяет восстановить тонкие детали строения.
Исследователи проверили метод на движущихся митохондриях и микротрубочках, а также на клеточных структурах, которые сливаются и разделяются. Такие быстрые изменения трудно зафиксировать способами, требующими нескольких экспозиций для одного сверхразрешающего изображения. «Наши эксперименты показывают, что SPIFFI способен фиксировать быстро движущиеся процессы внутри клеток и при этом обеспечивает высокопроизводительную многомерную визуализацию за пределами возможностей обычных микроскопов», — подводит итог Раденович.
Поскольку SPIFFI даёт сверхразрешающее изображение с каждой экспозиции камеры, последовательные кадры можно объединять в видео клеточной активности без потери пространственного разрешения. «С прежними методами множество снимков давало лишь один сверхразрешающий кадр. С SPIFFI каждый кадр является сверхразрешающим, поэтому теперь мы можем создавать сверхразрешающие видео живых клеток, — говорит Го. — Мы также без потерь объединили изображения SPIFFI с существующими флуктуационными методами постобработки и достигли разрешения около 80 нанометров». Сейчас команда работает над компактностью системы и её интеграцией с трёхмерной микроскопией. Оптические компоненты SPIFFI можно встраивать в существующие флуоресцентные микроскопы, поэтому в перспективе метод может пригодиться в клеточной биологии, нейробиологии, биофизике и разработке лекарств — особенно там, где нужно наблюдать быстрые структурные изменения в живых клетках.